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转录组（Transcriptome）是指特定细胞或组织中一起转录家具，包括信使RNA，核糖体RNA、转运RNA以及非编码RNA。转录组学（Transcriptomics）是使用高通量测序技巧，全面快速获取某一物种特定组织或器官在某一气象下RNA序列信息，并对其结构和抒发信息进行分析。

转录组测序（RNA-seq）等于诓骗高通量测序技巧将细胞或组织中一起或部分mRNA、small RNA和no-codingRNA进行测序分析的技巧。RNA-seq既不错提供定量分析，检测基因抒发水平各异，又不错提供结构分析，能发现珍稀转录本，精准地识别可变剪切位点、基因交融等，况且不依赖于参考基因组。

当今，转录组测序已经是开展分子生物学贪图、基因功能贪图、分子机制贪图中弗成或缺的一种技巧技能。在进行转录组测序之后，通常需要对分析后果中感兴趣的本体进行生物学考证。转录组测序研究的贪图可从基因/转录本抒发、结构分析和RNA修饰等多个维度启航，因而不错基于此，从抒发、序列或功能等方面形成完好的考证施行想路。围绕这个想路，以下提供了最为全面的转录组测序卑鄙施行考证规律。

1. 荧光定量PCR（qRT-PCR）考证基因未必转录本抒发情况

通过荧光定量PCR考证基因抒发水平，基于内参基因（管家基因：保管细胞基因代谢活动所必需的基因，在各组织和细胞中抒发相对知晓）的抒发水平，得回方针基因的相对定量水平，常见的内参基因包含GAPDH、β-Actin、18S rRNA等。

注：因qRT-PCR与转录组测序定量旨趣不同，一般提议温雅基因抒发趋势是否一致。

（Zhou B, et al. Eur. J. Immunol.2023）

2. Western Blot考证卵白抒发情况

通过Western Blot（免疫陈迹法）考证各异基因是否在翻译水平发生变化，应用特异性抗体，记号卵白水平变化。其旨趣是诓骗卵白质所带分子量不同，在凝胶电泳中产生不同的电泳速率而被分离。分离后的卵白质被升沉到PVDF 膜或 NC 膜上，以固相中的卵白质或多肽手脚抗原，与对应的抗体起免疫响应，再与酶或同位素记号的第二抗体起响应，经过底物显色或发射自显影以检测电泳分离的特异性主义基因抒发的卵白要素。常见的抗体类型包括兔抗、羊抗、鼠抗等。

注：贪图标明，卵白质与转录水平的研究性较弱，因此提议在贪图功能层面时，进行卵白质层面的考证。

（Pierattini B, et al. Mol Ther-Nucl Acids.2023）

3. Northern blot考证RNA含量

通过Northern blot考证RNA的抒发情况，且对主义片断大小检测有较高的颖悟度：Northern Blot 接管琼脂糖凝胶电泳，左证分子量大小不同将不同的RNA分离开来，然后将其原位升沉至固相复旧物（如尼龙膜、纤维膜等）上，再用记号过的DNA或RNA探针，依据碱基互补配对的原则进行杂交，随后进行显影或显色，以检测方针RNA方位位置，其显影强度则可交流方针RNA在所测样品中的相对含量。

（Kurihara Y, et al. Commun Biol. 2023）

1. RT-PCR考证可变剪切

通过RT-PCR考证可变剪切，其旨趣是在剪切事件发生区域遐想特异性引物以扩增特定片断，通过电泳分离家具并不雅察条带大小各异，从而考证是否存在不同的剪切体式。设施为左证IGV浏览器笃信发生的事件及对应区域的序列，在序列区域隔邻遐想特定引物，进行PCR扩增，笃信片断长度。

（Zhang H, et al. Physiol Plantarum.2023）

2. RACE考证Poly(A)

3' RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）是贪图mRNA 3’结尾的常用技能，因为mRNA可能具有多个3’结尾 PAC区域，因此可左证该特质遐想施行进行Poly(A)考证。区别于平庸的RT-PCR，3' RACE考证需要扩增出mRNA 3’结尾的统统条带，所使用的引物相对相比特等，正向引物录取在近端Poly(A)的左侧区域，而反向引物则录取在 Poly(A)位点上，对应cDNA上Poly(T)引物区域，响应标准和所用的响应体系不错按照RT-PCR来。

（Mukherjee S, et al. Front Immunol.2023）

3. RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）考证RNA定位

RNA-FISH（RNA荧光原位杂交）诓骗荧光记号的核酸探针与细胞内靶RNA分子进行特异性杂交，从而结束对RNA分子在细胞内原位定位的贪图。其旨趣基于碱基配对原则，通过遐想与方针RNA序列互补的探针，在细胞经过固定、透化处罚后，让探针干涉细胞并与RNA逢迎，通过荧显豁微镜不雅察到的荧光信号可精准线路RNA在细胞内的散播情况。

（Mamontova V, et al. bioRxiv. 2024）

1. 雀斑杂交（Dot blot）

雀斑杂交（Dot blot）可检测和果决 DNA、RNA 和卵白质，通过显影雀斑的有无及神气的浅深来判断是否有杂交过火杂交强度。在贪图 RNA 修饰时，雀斑杂交常用于对细胞内总RNA的修饰水平进行定性或半定量分析。具体设施是：将待测的 RNA 变性后点加在硝酸纤维素膜或 NC 膜上，紫酬酢联固定后，用m6A未必m5C抗体进行杂交，洗膜，发射自显影，以雀斑有无或神气的浅深代表RNA修饰水平的上下。

（Sun B, et al. Plos Genet. 2022）

2. 质谱检测法（HPLC/LC-MS）

HPLC接管串联质谱的花式，通过逢迎酶处罚和离子打碎，将核酸打断成核苷和碱基，左证出峰保留期间和峰面积，贪图m6A和总腺嘌呤的比例，得到mRNA的全体m6A甲基化进程。然则，此种规律无法明确发生修饰的具体RNA以及修饰的具体位置。

（Liu C, et al. Nat Biotechnol. 2022）

3. MeRIP-qPCR

用以对方针基因上的某个修饰位点（以一小段区域的体式，MeRIP法精准不到单碱基）的修饰水平进行考证。其旨趣同MeRIP-seq测序中MeRIP施行相似，施行基本操作也一致：对RNA进行片断化，然后将片断化后的RNA样品分为二部分：一部分用于免疫共千里淀施行（IP）后手脚IP样品，另一部分不进行IP径直手脚Input样品。之后再左证施行主义的不同，对两部分RNA片断进行逆转录和qPCR。

（Price A M, et al. Nat Commun. 2020）

4. MeRIP-seq

meRIP-seq是参考Chip-seq发展出来的一种果决RNA修饰的规律，当今meRIP-seq已见效应用于m6A和m5C的检测。其旨趣和设施为：率先通过polyA拿获mRNA，未必通过rRNA剔除技巧去掉rRNA，然后将得回的RNA打成100nt傍边的小片断；之后使用修饰特异性的抗体（m6A或m5C抗体）进行免疫共千里淀，含有修饰的RNA片断被富集并回收；进而对回收的RNA进行文库构建、高通量测序和生物信息学分析，通过peak分析果决出RNA修饰的区域。

1. 基因敲除

基因敲除是通过不同政策结束方针基因功能丧失以真切商酌其生物学作用的关节技巧。主要包括插入突变、RNA侵犯和CRISPR/Cas9基因剪辑三种规律。其中RNA侵犯是通过遐想与内源mRNA同源的dsRNA，经Dicer酶加工成siRNA，形成RISC复合物切割靶mRNA，阻难基因抒发；CRISPR/Cas9系统诓骗sgRNA带领Cas9卵白在基因组精准位置切割DNA，通过NHEJ缔造机制酿成基因功能丧失。

2. 基因过抒发

基因过抒发是通过将方针基因编码区序列CDS构建到质粒或病毒等载体上，诓骗载体上的调控元件结束基因在东说念主为适度要求下的多半转录和翻译。这也曾由有两种主要政策：瞬时转染和知晓转染。瞬时转染是将外源基因载入细胞但并不整合到染色体中，能在短期内获取高水平的基因抒发财具，适用于快速制备极少至中量的重组卵白；知晓转染则是将主义基因整合到宿主细胞染色体中，形成知晓抒发且不错遗传给后代的细胞株。

1. 双荧光素酶检磨练证RNA与RNA互作

双荧光素酶检测可用于考证RNA与RNA互作。其基首肯趣是将待测RNA片断辞别与两种酶陈述基因构建交融抒发载体，各自产生不同类型的荧光信号。施行中，当两种含有所贪图RNA片断的交融卵白在细胞内抒发时，若这两种RNA之间存在互作，则会转换各自的构象或知晓性，进而影响各自所蚁集的荧光素酶活性。通过检测荧光信号强度的变化，即可判断RNA间是否存在相互作用。

2. RNA pull-down考证RNA与卵白互作

RNA pull-down是通过特定的RNA分子（常常是已知的非编码RNA或mRNA的片断）来富集与之相互作用的卵白质，以便进一步贪图RNA与卵白的互作。该施行是在已知主义RNA存不才，商酌与其逢迎的卵白。RNA pull-down是使用体外转录法记号生物素RNA探针，然后与胞浆卵白提真金不怕火液共同孵育，形成RNA-卵白质复合物。该复合物可与链霉亲和素记号的磁珠逢迎，从而与孵育液中的其他要素分离。再诓骗游离生物素竞争洗脱复合物，通过Western Blot施行检测特定的RNA逢迎卵白是否与RNA相互作用，未必逢迎质谱（Mass Spectrometry）筛选RNA逢迎的未知卵白。

3. 酵母双杂交考证卵白与卵白互作

酵母双杂交技巧是一种诓骗活体酵母细胞来检测和考证两个方针卵白质之间是否存在相互作用的规律。其基首肯趣是将待测卵白A与酵母转录因子的激活扣构域交融抒发，同期将卵白B与转录因子的DNA逢迎结构域交融抒发。当卵白A和卵白B在酵母细胞内发生相互作用时，会重新拼装成一个完好的功能性转录因子，进而激活特定陈述基因的抒发。施行设檀越要包括构建交融卵白抒发载体、转入酵母细胞、筛选阳性克隆以及陈述基因活性检测。通过不雅察酵母细胞的滋长情况及陈述基因抒发水平，即可判断两种卵白质间是否存在相互作用。（泉源：贝纳科技）